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实验一植物原生质体的分离和培养一．教学目标：了解植物原生质体作为细胞工程研究的重要意义，了解原生质体活性鉴定的原理。掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原理和方法。二．重点：掌握分离和培养原生质体的技术、方法和原理。掌握细胞活性的检测方法。掌握细胞计数的原理和方法。三．难点：分离和培养原生质体的技术。四．授课方式与教学方法：讲解原理、实验操作示范或具体指导。五．教学内容:实验原理植物原生质体(protoplast)是除去细胞壁后为原生质所包围的“裸露细胞”,是开展基础研究的理想材料。其中,酶解法分离原生质体是一个常用的技术,其原理是植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素和果胶质组成,因而使用纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶能降解细胞壁成分,除去细胞壁,即可得到原生质体。由于原生质体内部与外界环境之间仅隔一层薄薄的细胞膜,必须保持在渗透压平衡的溶液中才能保持其完整性,使原生质体分离后不致膨胀破裂，渗透剂常用甘露醇或蔗糖，酶液还应含一定Ca2+来稳定原生质膜。其次,还应当考虑取材、酶的种类和纯度、酶液的渗透压、酶解时间及温度等因素对分离原生质体的影响。将原生质体接种在培养基上进行培养，细胞壁再生，细胞分裂和再生植株。测定原生质体的活性有多种方法。荧光素双醋酸酯(FDA)染色是常用的一种方法,FAD本身无荧光,无极性,可透过完整的原生质膜。一旦进入原生质体后,由于受到酯酶分解而产生具有荧光的极性物质荧光素。它不能自由出入原生质膜,因此有活力的细胞能产生荧光,无活力的原生质体不能分解FAD无荧光产生。细胞计数一般用血细胞计数极，按白细胞计数法进行计数。从理论上讲，植物体的任何一部分都可以通过酶解作用去除细胞壁而得到原生质体。但在实际操作中，只有幼嫩的组织才能完成去壁的过程。所以，为了制备健康的原生质体，一般选用根尖、茎尖、嫩叶及对数生长期的愈伤组织为材料，一旦细胞具有木质化或次生加厚的外壁，则不能被酶降解。因此，取材成为实验成功与否的首要问题。花期短的花瓣，由于其组织鲜嫩，又具有色素标记，是该实验中较好的材料。实验方法1．把叶片(或花期短的花瓣)洗净，把表面水吸干。（2人一组）2．撕去叶片背面的表皮，用2ml离心管的盖打下1圆片。圆片扣压于0.5ml酶液面上。让去除下表皮的一面接触酶液，辅满一层。0.5ml酶液已放入2ml离心管中。（酶液：4%纤维素酶，2%果胶覆酶，PH5.8，0.6mol/L甘露醇）。3．28~30℃保温酶解2~6h（放培养箱中）；镜检叶肉细胞原生质体。用血球计数板计数。4．600rpm离心5min，使原生质体沉降。吸除上面的酶液。5．加0.2mol/L的加氯化钙液0.5ml，轻轻吹打均匀。6．用1mL注射器向离心管底部缓缓注入20%的蔗糖溶液1ml，出现下部蔗糖液，上部原生质体悬浮液.以600rpm离心10min，在两液相之间出现一条绿色带，便是纯净的原生质体。7．用1mL注射器取出管底的杂质、下部蔗糖溶液和上部氯化钙液。少许原生质体于载片上，盖片观察其形态，检测纯度。8．加MS培养液液1ml洗涤，轻轻混匀，600rpm离心5min，使原生质体沉降。吸除上面的溶液。9．加MS培养液液0.5ml,轻轻混匀,用血球计数板计数细胞密度,FDA染色测定原生质体的活性。10．扣上盖子，在26℃下进行暗培养。观察细胞壁的再生和细胞分裂。实验结果结果讨论六．课堂小结：根据学生的实验结果进行总结。细胞计数板的使用：细胞计数板系一长方形厚玻片，常用的改良牛氏(Improved-Neubauer)计数板在中央横沟的两边各有一计数室，两计数室结构完全相同。计数室较两边的盖玻片支柱低0.1毫米。因此，放上盖玻片时，计数板与其间距即计数室空间的高为0.1毫米(图8-1)。在低倍显微镜下可见计数室被双线划分成９个边长为１毫米的大方格。四角的大方格又各分为１６个中方格，这是用来计数白细胞的。中央大方格被划分为２５个中方格，每一中方格又划分成１６个小方格(图8－2称２５×１６=400小方格，也有的计数板为１６×２５=400格的，小方格面积一致)。中央大方格的四角及中心５个中方格(１６×２５者则为四角上的中方格)为红细胞或血小板计数范围。细胞计数先用试管稀释法制备禽类血细胞悬液：将禽类红细胞稀释液Ⅰ、Ⅱ分别置水浴锅中预热到４１～４２℃，取Ⅰ液１mL于试管中，用吸血管加入新鲜鸡血(或肝素抗凝血)２０霯，再加入Ⅱ液１mL混匀，置该水浴锅中保温５０s左右，置室温，即为待检的血细胞悬液。可用于充液计数。取干洁的计数板，置于水平的显微镜载物台上，盖上盖玻片，使两侧各空出少许。摇匀血细胞悬液，用滴管吸取，将滴管尖轻轻置于盖玻片边缘外，让滴出的血细胞悬液凭毛细管作用吸入计数室内，刚好充满计数室为宜(图8－3)。静置２min后计数，先用低倍镜观察，不均匀则抛弃。计数时用虹彩、集光器、反光镜等调节入射光角度和强度，认清计数室位置。采用“由上至下，由左至右，顺序如弓”的顺序，对压边线细胞采取“数上不数下，数左不数右”的原则(图8～4)。依次计数并记录５个中方格中分别有多少个红细胞。注意事项1．计数板、盖玻片和测定管用清水冲洗，再用绸布或细布沾干。2．.充液前应充分混匀血细胞悬液，充液要连续、适量，充液后应待血细胞下沉后再计数。3.计数板、盖玻片、吸血管及测定管等用过后必须立即按要求洗涤干净。实验二、细胞膜的通透性观察实验目的了解细胞膜的渗透性及各类物质进入细胞的速度。实验原理将红细胞放入数种等渗溶液中，由于红细胞对各种溶质的透性不同，有的溶质可以渗入，有的不能渗入，渗入的溶质能够提高红细胞的渗透压，所以促使水分进入细胞，引起溶血，由于溶质透入速度互不相同，因此溶血时间也不相同。实验用品一、器材50ml烧杯,试管（1～10cm）,10ml移液管,试管架。二、材料羊血。三、试剂0.17mol/L氯化钠，0.17mol/L氯化胺，0.17mol/L醋酸胺，0.17mol/L硝酸钠，0.12mol/草酸胺，0.12mol/硫酸钠，0.32mol/葡萄糖，0.32mol/甘油，0.32mol/乙醇，0.32mol/丙酮。实验方法一、羊血细胞悬液取50ml小烧杯一个，加1份羊血和10份0.17mol/L氯化钠，形成一种不透明的红色液体，此即稀释的羊血。二、低渗溶液取试管一支，加入10ml蒸馏水，再加入1ml稀释羊血，注意观察溶液颜色的变化，有不透明的红色逐渐澄清，说明红细胞发生破裂造成100%红细胞溶血，使光线比较容易透过溶液。三、羊红细胞的渗透性1、取试管一支，加入0.17mol/L氯化钠10ml，再加入1ml稀释羊血，轻轻摇动，注意观察溶液颜色有无变化？有无溶血现象？为什么？2、取试管一支，加入0.17mol/L氯化胺10ml，再加入1ml稀释羊血，轻轻摇动，注意观察溶液颜色有无变化？有无溶血现象？为什么？3、分别在另外8种等渗溶液中进行同样实验。步骤同2。实验结果并对实验结果进行比较和分析。实验三细胞骨架的观察一、实验目的掌握用光学显微镜观察植物细胞骨架的原理及方法，观察光学显微镜下细胞骨架的网状结构。二、实验原理植物细胞用适当浓度的TritonX—100处理后，可破坏细胞内蛋白质，但细胞骨架系统的蛋白质却保护完好。考马斯亮蓝R250(CoomassiebrilliantblueR250)是一种蛋白质染料，处理后的材料用考马斯亮蓝R250(考马斯亮蓝R250)染色后，用光学显微镜观察，可以见到一种网状结构，即是细胞骨架结构。三、材料洋葱鳞叶四、试剂1)2％考马斯亮蓝R250染色液：称考马斯亮蓝R2501g，溶于250ml无水乙醇中，加冰醋酸35ml.再加蒸馏至500ml.(2)磷酸缓冲液(pH6．8)：6．0mmol／L磷酸缓冲液，调至pH6.8(3)M缓冲液(pH7．2)50mmol／L咪唑，50mmol/L)氯化钾、0．5mmol／L氯化镁、1mmol/L乙二醇(a-氨基乙基)醚四乙酸、0.1mmol/L乙二胺四乙酸；1mmol／L巯基乙醇，调至pH7．2。(4)1%TrionX-100：用M缓冲液配制。(5)3%戊二醛：用磷酸缓冲液配制；(6)中性树胶。仪器(请参看仪器图库)：显微镜，烧杯，镊子。玻璃滴管，载玻片五、实验步骤1.用镊子撕取洋葱鳞叶内侧的表皮若干片约1cm2大小若干片)，置于50mL烧杯中，加入pH6.8磷酸缓冲液，使其下沉；2.吸去磷酸缓冲液，用1％TritonX—100处理20min。3.吸去TritonX—100，用M缓冲液洗3次,每次5min。4.用3％戊二醛固定30min。5.磷酸缓冲液(pH6．8)洗3次，每次5min。6.0.2%考马斯亮蓝R250染色10min。7.蒸馏水洗2次，然后将样品置于载玻片上,加盖玻片，于普通光学显微镜下观察。8.如果染色效果好，则可依次用50％乙醇、70%乙醇,95％乙醇、正丁醇、二甲苯处理样品,各5min,然后将样品平展于载玻片上，加一滴中性树胶，盖上盖玻片封片，制成永久切片。六、实验报告描绘所观察到的洋葱鳞叶细胞骨架图。实验四、线粒体和液泡系的超活染色与观察活体染色是能使生活有机体的细胞或组织特异性着色但对活样品又没有毒害作用的一种活体染色方法，其目的是显示生活细胞内的某些结构，而不影响细胞的生命活动和产生任何物理、化学变化以致引起细胞的死亡。活体染色技术可用来研究生活状态下的细胞形态结构和生理、病理状态。通常把活体染色分为体内活体染色与体外活体染色两类。体外活体染色又称超活染色，它是由活的动、植物分离出部分细胞或组织小块，以染料溶液浸染，染料被选择固定在活细胞的某种结构上而显色。活体染料之所以能固定、堆积在细胞内某些特殊的部分，主要是靠染料的“电化学”特性。碱性染料的胶粒表面带阳离子，酸性染料的胶粒表面带有阴离子，而被染的部分本身也是具有阴离子或阳离子，这样，它们彼此之间就发生了吸引作用。但并非任何染料均可用于活体染色，理论上应选择那些对细胞无毒性或毒性极小的染料，且使用时需要配成稀淡的溶液。一般说来，最为适用的是碱性染料，这可能是因为它具有溶解在类脂质(如卵磷脂、胆固醇等)的特性，易于被细胞吸收。詹纳斯绿B(JanusgreenB)和中性红(neutralred)两种碱性染料是活体染色剂中最重要的染料，对于线粒体和液泡系的染色分别具有专一性。实验目的1、观察动、植物活细胞内线粒体、液泡系的形态、数量与分布；2、学习一些细胞器的超活染色技术。实验原理线粒体是细胞内一种重要细胞器，是细胞进行呼吸作用的场所。细胞的各项活动所需要的能量，主要是通过线粒体呼吸作用来提供的。活体染色是应用无毒或毒性较小的染色剂真实地显示活细胞内某些结构而又很少影响细胞生命活动的一种染色方法。詹纳斯绿B是线垃体的专一性活体染色剂。线粒体中细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态(即有色状态)呈蓝绿色，而在周围的细胞质中染料被还原，成为无色状态。中性红为弱碱性染料，对液泡系(即高尔基体)的染色有专一性，只将活细胞中的液泡系染成红色，细胞核与细胞质完全不着色，这可能是与液泡中某些蛋白质有关。实验用品1、器材显微镜、恒温水浴锅、解剖盘、剪刀、镊子、双面刀片、解剖盘．载玻片、凹面载玻片、盖玻片、表面皿、吸管、牙签、吸水纸。2、试剂（1）Ringer溶液：氯化钠0.85g(变温动物用0.65g)氯化钾0.25g氯化钾0.25g氯化钙0.03g蒸馏水100ml（2）10%、1/3000中性红溶液：称取0.5g中性红溶于50mlRinger液，稍加热(30~40℃)使之很快溶解，用滤纸过滤，装入棕色瓶于暗处保存，否则易氧化沉淀，失去染色能力。临用前，取已配制的1%中性红溶液1ml，加入29mlRinger溶液混匀，装入棕色瓶备用。（3）1%、1/5000詹纳斯绿B溶液称取50mg詹纳斯绿B溶于5mlRinger溶液中，稍加微热(30~40℃)，使之溶解，用滤纸过滤后，即为1%原液。取1%原液lml加入49mlRinger溶液，即成1/5000工作液装入瓶中备用。最好现用现配，以保持它的充分氧化能力。实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