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第四章多肽与蛋白质类药物多肽与蛋白质类药物第一节多肽及蛋白质类药物的生产方法第二节多肽类药物第三节蛋白类药物多肽与蛋白质类药物第一节多肽及蛋白质类药物的生产方法1.蛋白质类药物的分离纯化2.多肽与蛋白质的化学合成3.基因工程法第二节多肽类药物第三节蛋白类药物多肽与蛋白质类药物第一节多肽及蛋白质类药物的生产方法第二节多肽类药物1.概述2.主要多肽类药物3.主要多肽类药物制备第三节蛋白类药物多肽与蛋白质类药物第一节多肽及蛋白质类药物的生产方法第二节多肽类药物第三节蛋白类药物1.概述2.主要蛋白质类药物的制备蛋白质类药物的分离与纯化（一）材料选择（二）蛋白质提纯的一般方法（三）蛋白质的分离和纯化（四）溶液中蛋白质浓度的测定（五）纯度检查（一）材料选择原料来源包括动物、植物及微生物等。选择原料时应考虑来源丰富、目的物含量高、成本低且易于提取的材料。同时应考虑其种属、发育阶段、生物状态、来源、解剖部位、生物技术产品的宿主菌或细胞等因素的影响。㈡提取是分离纯化的第一步，是将目的物从复杂的生物体系中转移到特定的人工液相体系中。提取的总要求是最大限度的把有效成分提取出来，关键是溶剂的选择。选择标准：首先对制备物有最大的溶解度，并在提取中尽可能减少一些不必要的成分。㈢蛋白质提纯的一般方法1．根据蛋白质等电点的不同来纯化蛋白质。2．根据蛋白质分子形状和大小不同来纯化蛋白质。㈢蛋白质提纯的一般方法3．根据溶解度的不同来纯化蛋白质。4．根据电离性质的不同来纯化蛋白质。对蛋白质的离子交换层析，一般多用离子交换纤维和以葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等为骨架的离子交换剂，主要是取其具有较大的蛋白质吸附容量，较高的流速和分辨率等优点。㈢蛋白质提纯的一般方法5．根据蛋白质功能专一性的不同来纯化蛋白质亲和层析法固相化金属亲和层析：干扰素、胃肠道多肽6．根据蛋白质疏水基团与相应的载体基团结合来纯化蛋白质。7．根据蛋白质在溶剂系统中分配的不同来纯化蛋白质㈢蛋白质提纯的一般方法8．根据蛋白质的选择性吸附性质来纯化蛋白质。9．根据酶对蛋白质的作用来纯化蛋白质。SOD（四）溶液中蛋白质浓度的测定1.UV法（1）280nm光吸收法（2）280nm和260nm的吸收差法蛋白质浓度(mg/ml)=1.45A280-0.74A2602.双缩脲法:540nm3.福林-酚试剂法:750nm4.考马斯亮蓝G-250染色法:595nm（五）纯度检查确定protein的纯度标准一般为：分子大小是否均一，电荷是否均一，是否具有恒定的氨基酸组成，是否具有单一的N端和C端残基，能否结晶，进一步纯化时生物活性是否有所提高等。（五）纯度检查常用蛋白质纯度检查的方法有：1．HPLC或FPLC2．电泳均一性3．免疫化学法4．生物测定法5.分光光度法：A280/A260为1.75多肽与蛋白质的化学合成多肽合成可以验证一个新的多肽的结构；设计新的多肽，用于研究结构与功能的关系；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；也是多肽药物制备的有效方法。多肽合成是一个重复添加氨基酸的过程，合成一般从C端向N端进行。固相法合成多肽省时、省料、便于计算机控制、便于普及推广主要步骤：⑴基团保护：把不应与接肽试剂发生作用的官能团，加以封闭和保护。肽链形成之后，再将保护剂去除。⑵肽的合成：液相合成固相合成⑶合成肽链的纯化基因工程法基因工程技术就是将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构成工程菌，实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。1982年第一个基因重组产品--人胰岛素优点：①可以大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽；②提供足够数量的生理活性物质，以便对其进行深入研究，扩大应用范围；③生理活性物质作为药物使用时存在的不足之处，可以通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；④利用基因工程可获得新型化合物，扩大药物来源。多肽类概述由氨基酸缩合而成的化合物称为多肽，它们是通过一个氨基酸分子的-NH与另一分子氨基酸的-COOH脱去一分子水形成-CO-NH-键而相互连接起来的。概述一般将50或50个以下的氨基酸残基组成的化合物，列入多肽。多数无特定空间构象，某些多肽也有一定构象，但其构象的坚固性远不如蛋白质，其构象的浮动性很大。多肽在生物体内的浓度很低，在血液中一般为,但它们的生理活性很强，在调节生理功能时起着非常重要的作用。101210~10/molL概述活性多肽主要是从内分泌腺、组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的。1953年人工合成了第一个有生物活性的多肽——催产素（OT）。到了60、70年代神经肽的研究进入高潮。同时，由于很多脑活性肽也存在于胃肠道组织中，从而推动了胃肠道激素的研究.到了70年代，生物技术的发展更开拓了多肽药物的新领域——细胞生长调节因子。现已发现的细胞生长调节因子已近100种.概述许多活性蛋白质和多肽都是由无活性的蛋白质前体，经过酶的加工剪切转化而来的。它们中间许多有共同的来源，相似的结构，甚至还保留着若干彼此所特有的生物活性。研究活性多肽结构与功能的关系及活性多肽之间结构的异同与其活性的关系,将有助于设计和研制新的活性多肽药物。临床上有一些确有疗效的组织提取制剂其有效成分有的还不十分清楚，从活性肽或细胞生长调节因子的角度去研究它们的物质基础和作用机制，预计可获得成效主要多肽类药物1．多肽激素①垂体多肽激素：促皮质素（ACTH），促黑激素（MSH）②下丘脑激素：促甲状腺激素释放激素（TRH），生长素抑制激素（GRIF）③甲状腺激素：甲状旁腺激素（PTH），降钙素（CT）。④胰岛激素：胰高血糖素，胰解痉多肽。⑤胃肠胃道激素：胃泌素，胆囊收缩素一促胰激素（CCK-PZ）⑥胸腺激素：胸腺素、胸腺肽主要多肽类药物2．多肽类细胞生长调节因子表皮生长因子（EGF）、转移因子（TF）、心钠素（ANP）等。3．含有多肽成分的其他生化药物骨宁、血活素等。主要多肽类药物制备（一）胸腺激素（二）促皮质素（ACTH）（三）降钙素（一）胸腺激素胸腺是一个激素分泌器官。对免疫功能有多方面的影响。胸腺位于纵隔腔上部，胸骨后方.胸腺发生于胚胎第二个月。到出生二年内，生长迅速，体积较大，到青春期仍继续发育，青春期后发生萎缩。因此胸腺原料必须采自幼龄动物（一）胸腺激素胸腺依赖性的淋巴细胞群——T细胞直接参与有关免疫反应T细胞主司细胞免疫（机体在特异抗原的刺激下，以T细胞为主产生致敏淋巴细胞的免疫反应称细胞免疫）。细胞分化分裂为胸腺骨髓的干细胸胸腺激素迁移T部分留在胸腺部分到脾脏淋巴结等周围免疫器官中定居主要胸腺激素制剂名称化学性质胸腺素组分5一族酸性多肽，MW1000～15000猪胸腺素注射液多肽混合物，MW15000以下胸腺素a1具有28个氨基酸残基的多肽，MW5562，pI4.2胸腺体液因子多肽，MW3200，pI5.7血清胸腺因子9肽，MW857，pI7.5胸腺生成素具有49个氨基酸残基的多肽，MW5562，pI5.7胸腺因子X多肽，MW4200胸腺刺激素多肽混合物自身稳定胸腺激素糖肽，MW1800～2500注：MW＝分子量；pI＝等电点（一）胸腺激素－胸腺素以胸腺为原料，按一定方法提取纯化胸腺的第五种组分。组分5，由在80℃热稳定的40～50种多肽组成的混合物，MW为1.000～15.000。pI3.5～9.5。分三个区域：α区，β区，γ区。其中，主要活性组分为α1、α5、α7、β3、β4等。（一）胸腺激素－胸腺素主要生物学功能表现在：连续诱导T细胞分化发育的各个阶段，放大并增强成熟T细胞对抗原或其他刺激物的反应，维持机体的免疫平衡状态（一）胸腺激素－胸腺素工艺路线（一）胸腺激素－胸腺素检验方法：活力测定：E-玫瑰花结升高百分数不得低于10%。（T细胞与绵羊红细胞产生E-玫瑰花结）。分子量15.000。以下作用与用途：免疫调节剂临床用于免疫缺陷病、自身免疫病、变态反应性疾病、细胞免疫功能减退的中老年人疾病、抗衰老、抗肿瘤的治疗。（一）胸腺激素－胸腺肽是从幼年动物的胸腺中提取制备的一种具高活力的混合肽类药物制剂。MW是9.600和7.000左右的两类蛋白质或肽类，氨基酸的组成达15种，必需氨基酸含量高，还含有RNA、DNA、对热较稳定，加温80℃生物活性不降低。经蛋白水解酶作用，生物活性消失（一）胸腺激素－胸腺肽工艺路线（一）胸腺激素－胸腺肽检验方法：活力测定同胸腺素。分子量10.000以下。作用与用途：调节细胞免疫功能，有较好的抗衰老和抗病毒作用。适用于原发性和继发性免疫缺陷病以及因免疫功能失调引起的疾病。对肿瘤有良好的辅助治疗作用。也用于贫血、肝炎等。无过敏反应和不良的副作用。（二）促皮质素（ACTH）脑垂体包括腺垂体和神经垂体，可分泌多种激素（表13.7）结构和性质：促皮质素是从垂体前叶提取出来的一种多肽激素。MW约为4600。易溶于水，pI6.6，经100℃加热，活力不减，由39个氨基酸残基组成，其24肽（1～24位氨基酸残基）已具有全部活性。（二）促皮质素（ACTH）（二）促皮质素（ACTH）－工艺路线（二）促皮质素（ACTH）ACTH冻干制剂每瓶25、50u，还可制成长效制剂。如ACTH-Zn注射液，ACTH-P,Zn混悬液。合成的促皮质素类似物有促皮质18肽、24肽、25肽等。检验方法：ACTH粗品（每1u/mg以上）用小白鼠胸腺萎缩法测定。ACTH精品（每45u/mg以上）用去垂体大白鼠的肾上腺维生素C降低法测定。（二）促皮质素（ACTH）例：促皮质素ACTH粗品（1u/mg以上）用小白鼠胸腺萎缩法测定。基于ACTH能延缓胸腺前身细胞（淋巴细胞）的成熟，导致胸腺萎缩。ACTH对数剂量与一定体重下胸腺重量的平方根呈线性关系（反比）。（二）促皮质素（ACTH）－检定法供试用动物，出生18～23天、体重8～13g的健康小白鼠，雌雄均可，每次试验各鼠间出生天数和体重相差不得过3天和3g。取供试用小鼠，随机均衡分为4组，每组动物不少于15只。每天分别给各鼠皮下注射0.1ml标准品或供试品高低剂量混悬液，共三天。最后一次注完,隔24hr，将小鼠麻醉处死。逐个称体重，剖开胸腔，小心摘取胸腺，剥离附着组织，用滤纸吸干液体，用扭力天平迅速称取胸腺重量，换算成每百克体重胸腺重量的平方根，按生物检定统计法进行结果处理。（二）促皮质素（ACTH）－作用与用途ACTH能维持肾上腺皮质的正常功能，促进皮质激素的合成和分泌，用于结缔组织病（关节炎、红斑狼疮、干癣）。也用于过敏症,如严重喘息、药物过敏和荨麻疹等。也可改善老年人及智力迟钝儿童的学习记忆能力。（三）降钙素（CT）－结构和性质CT是一种调节血钙浓度的多肽激素，由甲状腺内的C细胞分泌，由32个氨基酸残基组成，C-端为脯氨酸，如果去掉则生物活性完全消失。溶于水和碱性溶液。CT广泛存在于多种动物体内，既存在于哺乳动物的甲状腺、胸腺和肾上腺等组织中，也存在于鱼类如鲑鱼的终鳃体。（三）降钙素（CT）－工艺路线（三）降钙素（CT）－检验方法生物活性测定法：降钙素用0.1%白蛋白溶解，在雄性大白鼠进行静脉注射，1hr收集血样，原子吸收光谱法测定血清钙值，同时，用MRC标准品作对照。（三）降钙素（CT）－作用与用途主要功能是降低血钙，用于骨质疏松、高血钙症、畸形性骨炎等。用化学合成和基因工程技术制备降钙素已获成功蛋白类概述（一）蛋白类药物的分类（二）蛋白类药物作用方式（三）应用基因工程技术制备重要的蛋白类药物（四）蛋白质工程技术的应用（一）蛋白类药物的分类1．蛋白质激素（1）垂体蛋白质激素（2）促性腺激素（3）胰岛素及其他蛋白质激素2．血浆蛋白质如白蛋白，丙种球蛋白。3．蛋白质类细胞生长调节因子干扰素α、β、γ，广谱抗病毒剂，白介素，肿瘤坏死因子（一）蛋白类药物的分类4．粘蛋白如胃膜素等。治
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