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41五子衍宗方主要药效学成分药代动力学方法研究项目完成单位：国家药物及代谢产物分析研究中心项目完成人：马辰五子衍宗方为中药经典古方，源自唐代《悬解录》。其功用主治为补肾益精，用于治疗肾虚腰痛，尿后余沥，以及不孕不育症等。中国药典以成方制剂五子衍宗丸形式收载，其处方组成为：菟丝子400g、枸杞子400g、覆盆子200g、车前子100g和五味子50g。在五子衍宗方中菟丝子和枸杞子为方中的君药。目前中国药典对五子衍宗丸仅有性状和定性鉴别，未有含量测定。菟丝子为旋花科植物菟丝子CuscutachinensisLam.的干燥成熟种子，为常用中药，具有滋补肝肾、固精缩尿、安胎、明目、止泻等作用，其中黄酮类化合物为主要成分。目前从菟丝子中提取并鉴定出结构的黄酮类成分有金丝桃苷、槲皮素、紫云英苷、山奈酚等。目前中国药典2000版一部中，未对菟丝子进行含量测定。菟丝子中含有的主要化学成分以槲皮素及其苷为主，其中金丝桃苷为含量较高的槲皮素苷，因此对菟丝子和五子衍宗方进行含量测定时，以金丝桃苷为指标成分，其理化性质及结构如下：物理性状：淡黄色针状结晶（乙醇），熔点227～230℃（237～239℃分解），比旋度[α]20D=-83。（C=0.2吡啶），易溶于甲醇、乙醇、丙酮及吡啶。金丝桃苷化学结构：OHOOHOOHOHgalactose一、五子衍宗方及菟丝子中金丝桃苷的含量测定1实验材料及仪器设备1.1药品及试剂金丝桃苷对照品：本所植化室提供，纯度达95%以上五子衍宗方药材（菟丝子、枸杞子车前子、覆盆子、五味子）：北京同仁堂药店42磷酸（分析纯）；无水乙醇（分析纯）；乙腈（色谱纯）；Fisher甲醇：（色谱纯）；双蒸水1.2仪器设备Waters2690高效液相色谱仪及996-二极管阵列检测器，Millennium32色谱软件，有机相微孔滤膜（0.45µm）针头滤器，BUCHI461电热恒温水浴箱2色谱条件选择菟丝子及五子衍宗方中黄酮类成分较多，其中菟丝子中以槲皮素及其苷为主，五子衍宗方中除菟丝子含有黄酮类成分外，车钱子中也含有车钱苷等黄酮类成分。参考文献对菟丝子及五子衍宗中的金丝桃苷测定的色谱条件进行了优选。2.1检测波长的选择从金丝桃苷的紫外光谱Fig.1可见，其在254nm和355nm均有较大的吸收，文献中多以355nm作为对金丝桃苷的检测波长，主要考虑其它干扰成分在此吸收较低。因此本论文对菟丝子中含量测定时，首先考虑了355nm作为检测波长，而对五子衍宗方进行含量测定时，其他成分对主峰有干扰，而主要干扰成分在254nm却有较低的吸收，并与主峰能实现基线分离。因此对五子衍宗方中的金丝桃苷进行含量测定时选用了254nm。图1金丝桃苷甲醇溶液的紫外光谱2.2流动相的选择首先以流动相甲醇－0.5%磷酸（50：50，用三乙胺调pH至3.0），实验中发现柱效下降很快，分析认为使用三乙胺调pH，对色谱柱的损害太大。考虑到常规C18色谱柱的酸性适用范围，在上述流动相基础上分别考察了0.5%醋酸、0.05%三氟乙酸以及0.1%磷酸，从保留时间、分离度和拖尾因子角度进行评价，优选了最佳的流动相组成。最终确定甲醇：乙腈：0.1%磷酸(40:5:55)作为金丝桃苷流动相条件。2.3色谱条件色谱柱：AlltechC18柱（5μm，250mm×4.6mmi.d）流动相：甲醇-乙腈-0.1%磷酸水溶液（40：5：55）流速：0.8mL/min，柱温：25℃，43检测波长：355nm（菟丝子含量）；254nm（五子衍宗方含量）3实验溶液制备3.1对照品溶液的配制精密称取金丝桃苷标准品10mg置于10mL的容量瓶中，加入甲醇溶解并稀释至刻度，备用。精确量取上述金丝桃苷溶液2mL于10ml容量瓶中，配成200µg/mL的标准溶液。色谱图见Fig.2（355nm）和Fig.3（254nm）。图2金丝桃苷的HPLC图（355nm检测）图3金丝桃苷的HPLC图（254nm检测）3.2菟丝子供试品溶液制备3.2.1提取方法考察（1）提取溶剂的选择取菟丝子粉6份（过40目筛）各0.4g，精密称定，置150mL三角瓶中，分别精密加入44甲醇、95%乙醇、80%乙醇、60%乙醇、50%乙醇和40%乙醇各50mL，称重，加热回流提取2h，冷却至室温，补重，摇匀，以0.45µm滤膜过滤，即得，进样10µL，计算提取药材含量。结果见表Tab.1，实验数据表明以上溶剂中60%乙醇对金丝桃苷的提取率最高。表1对菟丝子提取溶剂的比较表SolventMeOH40%EtOH50%EtOH60%EtOH80%EtOH95%EtOHsampleweight(g)0.40070.40060.40130.39910.40170.4002Content(%)0.3420.3500.3520.3650.3530.297（2）提取时间的比较精密称取菟丝子粉4份各0.4g，加入50mL60％乙醇，称重，加热回流，分别提取0.5、1、2、3、4h，冷却至室温，补重，摇匀，以0.45µm滤膜过滤，即得，进样10µL，计算提取药材含量。结果见表Tab.2，实验数据表明热回流提取2h已经将菟丝子中的金丝桃苷提取完全。表2对菟丝子提取时间的比较Time0.5h1h2h3h4hsampleweight(g)0.39930.40120.40060.40090.4006Content(%)0.3150.3130.3220.3180.311（3）溶剂用量比较精密称取菟丝子粉3份各0.4g，分别加入35、50、60mL60％乙醇，称重，加热回流提取2h，冷却至室温，补重，摇匀，以0.45µm滤膜过滤，即得，进样10µL，计算药材含量。结果见表Tab.3。其中50mL溶剂即能提取完全表3对菟丝子提取溶剂体积的比较Volume35mL50ml60mLsampleweight(g)0.39950.40790.4008Content(%)0.4100.4110.3523.2.2菟丝子供试品溶液制备根据上述条件选择确定确定菟丝子提取方法为：取菟丝子细粉（过40目筛）0.4g，精密称定，置150mL三角瓶中，精密加入60%乙醇50mL，称重，加热回流提取2h，冷却至室温，补重，摇匀，以0.45µm滤膜过滤，即得，进样10µL。色谱图见Fig.445图4菟丝子60%乙醇提取液的HPLC图（355nm）3.3五子衍宗方供试品溶液制备3.3.1五子衍宗方提取方法考察（1）提取溶剂的选择按处方比例精密称取菟丝子0.4g、枸杞子0.4g、覆盆子0.2g、车钱子0.1g和五味子0.05g，以上药材均为细粉（过40目筛）4份，分别精密加入甲醇、80%乙醇、60%乙醇、50%乙醇和40%乙醇各50mL，称重，加热回流提取2h，冷却至室温，补重，摇匀，以0.45µm滤膜过滤，各进样10µL，求算溶剂提取的含量。结果见表Tab.4，表明60%乙醇对五子衍宗方中金丝桃苷的提取率最高。表4五子衍宗方提取溶剂的比较（2）提取时间按处方比例精密称取五子衍宗方1.15g，加入50mL60％乙醇，称重，加热回流，分别提取1、2、3、4h，冷却至室温，补重，摇匀，以0.45µm滤膜过滤，各进样10µL，求算溶剂提取的含量。结果见表Tab.5，实验数据表明热回流提取2.0h已经将五子衍宗方中的金丝桃苷提取完全。表5五子衍宗方提取时间的比较Time1h2h3h4hsampleweight（g）1.1611.1571.161.162Content(％)0.1170.1190.1180.115SolventMeOH50%EtOH60%EtOH80%EtOHsampleweight（g）1.1631.1661.1621.166content（％）0.1130.1060.1150.11346（3）溶剂用量比较按处方比例精密称取五子衍宗方1.15g，分别加入35、50、60mL60％乙醇，称重，加热回流提取2h，冷却至室温，补重，摇匀，以0.45µm滤膜过滤，各进样10µL，求算溶剂提取的含量。结果见表Tab.6。其中50mL溶剂即能将复方中的金丝桃苷提取完全。表6五子衍宗方提取溶剂体积的比较3.3.2五子衍宗方供试品制备根据上述条件选择，确定五子衍宗方中金丝桃苷的提取方法为：按处方比例精密称取菟丝子0.4g、枸杞子0.4g、覆盆子0.2g、车钱子0.1g和五味子0.05g，以上药材均为细粉（过40目筛）。精密加入60%乙醇50mL，称重，加热回流提取2h，冷却至室温，补重，摇匀，以0.45µm滤膜过滤，即得。色谱图见Fig.5（254nm）和Fig.7（355nm），缺菟丝子药材的色谱图见Fig.6（254nm）和Fig.8（355nm）。从色谱图可以看到，在355nm处干扰组分的色谱峰与金丝桃苷主峰未能完全分离，在254nm处，由于干扰峰吸收较低，对金丝桃苷主峰的影响不大。图5五子衍宗方60%乙醇提取液的HPLC图（254nm）Volume（mL)35mL50ml60mLsampleweight（g）1.1641.1611.159Content（％）0.1120.1140.11447图6缺菟丝子的五子衍宗方60%乙醇提取液的HPLC图（254nm）图7五子衍宗方60%乙醇提取液的HPLC图（355nm）48表8金丝桃苷的精密度(n=5)4方法学考察4.1标准曲线的建立精确量取1mL200µg/mL的金丝桃苷标准溶液，分别置于25mL、20mL、10mL、5mL和2mL容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，配成一系列的标准品溶液，依“色谱条件”分离，取10µL标准溶液进样。以标准液浓度（C）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，标准曲线见Fig.9。计算得回归方程为Y=25590.84C-3511.23，相关系数R=0.9999，线性范围为8.13－203.20µg/mL。0102030405060050100150200250Concentration(μg/mL)Peakarea(*100000)表9菟丝子测定精密度494.2最小检出限以信噪比（S/N）大于3测得金丝桃苷的最小检出限，测定结果见表Tab.7表7金丝桃苷的检测限Hyperoside254nm355nmDetectionlimits(ng)1.361.744.3精密度试验配制高、中、低浓度的金丝桃苷对照品溶液（浓度分别为203.20µg/mL，20.32µg/mL，8.13µg/mL），进样10µL，连续进样5次，测得峰面积，金丝桃苷不同浓度的相对标准偏差在0.52~1.96之间。结果见表Tab.8表8金丝桃苷的精密度(n=5)Concentration8.13μg/mL20.32μg/mL203.20μg/mLPeakarea19876751290251747552070955056335109594203905505746514063319999252609551229322067975253165160806X203311.2515138.45141744SD3823.8510089.6226654.43RSD%1.881.960.525菟丝子中金丝桃苷含量的测定5.1菟丝子供试品精密度实验取菟丝子细粉（过40目筛）0.4g，精密称定，按“3.2.2菟丝子供试品溶液制备”项，制备供试品溶液，连续进样5次，测得峰面积。结果见表Tab.9，其RSD为0.91%。表9菟丝子测定精密度Peakarea886810891043883854874905872011Averagearea881724.6SD8032.57RSD%0.91505.2重复性实验取同一批菟丝子样品，精密称取0.4g，共5份，各按“3.2.2菟丝子供试品溶液制备”项下制备，各进样10µL，求算含量。结果见表Tab.10。其RSD为0.76%表10菟丝子测定重复性Sample12345Sampleweigh(g)0.40120.40660.40220.40800.3991Content(%)0.4130.4190.4110.4150.416Avera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