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动物生物化学实验讲义东北农业大学动物生化教研室实验项目1γ–球蛋白的分离实验项目2γ–球蛋白含量测定（光度分析法）实验项目3凝胶柱层析法（γ–球蛋白纯化）实验项目4SDS–聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS–PAGE）实验项目5动物组织中DNA的制备实验项目6多聚酶链反应（PCR扩增反应）实验项目7琼脂糖凝胶电泳分离DNA实验项目8转氨酶GPT活性的测定实验项目9氨基酸薄层层析实验项目10琥珀酸脱氢酶及丙二酸的抑制作用实验一γ–球蛋白的分离【原理】中性盐（如硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、硫酸镁等）对球状蛋白质的溶解度有显著影响。随着中性盐浓度的增加，离子强度也增加。当溶液离子强度增加到一定数值时，溶液中蛋白质的溶解度开始下降。离子强度增加到足够高时，蛋白质可从水溶液中沉淀出来，这种现象叫做盐析。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的高浓度盐溶液来沉淀分离各种蛋白质。蛋白质是一种生物大分子，它具有不能通过半透膜的性质。透析就是利用这种性质使之与其它小分子物质如无机盐、单糖等分开。本次实验应用的是脱盐透析，即盐析后，将含大量盐类的蛋白质溶液放在半透膜的袋内，再将透析袋浸入蒸馏水中。经过一段时间，袋内的盐类浓度即逐渐降低。若经常更换袋外的液体，最后即可使袋内的蛋白质溶液中所含的盐类除净，从而达到脱盐的目的。应用不同浓度硫酸铵分段盐析法将血清中γ–球蛋白及α、β球蛋白分离，最后用透析法脱盐，即可得到纯度较高的γ–球蛋白。【试剂和器材】一试剂1．pH7.2，0.01mol/L磷酸盐缓冲液生理盐水（简称PBS）：取0.2mol/LNa2HPO4溶液36.0ml，0.2mol/LNaH2PO4溶液14.0ml混合，加NaCl8.5克，用蒸馏水稀释至1000ml。0.2mol/LNa2HPO4溶液：取28.4gNa2HPO4或71.6gNa2HPO4·12H2O用蒸馏水溶解稀释至1000ml。0.2mol/LNaH2PO4溶液：取24gNaH2PO4用蒸馏水溶解稀释至1000ml。2．pH7.2饱和硫酸铵溶液：取化学纯（NH4）2SO4800g，加蒸馏水1000ml，不断搅拌下加热至50～60℃，并保持数分钟，趁热过滤，滤液在室温中过夜，有结晶析出，即达到100％饱和度，使用时用浓氨水将饱和硫酸铵溶液调pH到7.2。3．纳氏试剂：纳氏试剂贮存液：于500ml三角烧瓶内加入碘化钾150克、碘110克、汞50克及蒸馏水l00ml，用力振荡7~15分钟，至碘色将转变时，此混合液即产生高热。随即将此烧瓶浸于冷水内振荡，直至棕色之碘转变成带绿色之碘化钾汞溶液为止。将上清液倾入2000ml量筒内，并用蒸馏水洗涤瓶内沉淀物数次。将洗涤液一并倾入量筒内，加蒸馏水至2000ml刻度后，混匀即成。纳氏试剂应用液：取10%氢氧化钠700ml，钠氏试剂贮存液150ml及蒸馏水150ml混匀即成，如显混浊，可静置数日后取上清液使用。此试剂之酸碱度极为重要。用lmol/L盐酸溶液20ml滴定时，需此试剂11～11.5ml恰好使酚酞指示剂变成红色时最为适宜。否则必须纠正其酸碱度。4．双缩脲试剂：溶解1.50克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0克酒石酸钾钠（NaKC4H406·4H20）于500ml蒸馏水中。在搅拌下加入10%氢氧化钠溶液300ml，用蒸馏水稀释到1升，贮存在内壁涂以石蜡的瓶中，可长期保存。5．浓蔗糖液：蔗糖的饱和溶液。6．10%氢氧化钠：取10克氢氧化钠溶解于蒸馏水中，定容至100ml。二器材1．透析袋。2．磁力搅拌器。3．离心机。三材料兔血清【操作】一盐析1．取离心管1支加入血清2ml，再加入等量PBS稀释血清，摇匀后，逐渐加入pH7.2饱和硫酸铵溶液2ml（相当于33%饱和度硫酸铵），边加边摇。然后静止半小时，再离心（3000r/min）20分钟，倾去上清液（主要含白蛋白）。2．用lmlPBS将离心管底部的沉淀搅拌溶解，再逐滴加饱和硫酸铵溶液0.5m1。摇匀后放置半小时，离心（3000r/min）20分钟，倾去上清液（主要含α、β球蛋白），其沉淀即为初步纯化的γ–球蛋白。如要得到更纯的γ–球蛋白，可重复盐析过程1～2次。3．把提取的γ–球蛋白用1mlPBS悬浮。二透析脱盐与浓缩1．将盐析得到的γ–球蛋白放入透析袋内，用线绳缚紧上口，用玻璃棒悬在盛有半杯蒸馏水的100ml烧杯中，使透析袋下半部浸入水中。2．将烧杯放在磁力搅拌器上搅拌1小时以上（中间换水1～2次），然后将透析袋取下。小心将线绳解开，吸取袋内的液体，与烧怀中的水同时用双缩脲试剂检查袋内外的蛋白质，用纳氏试剂检查袋内外液体中的铵离子（NH4+），观察透析法的脱盐效果。3．脱盐后得到的γ–球蛋白溶液可继续浓缩，即用透析袋装好悬于盛有10ml浓蔗糖或聚乙二醇溶液的小烧杯内1小时以上，观察袋内液体体积的变化。实验二γ–球蛋白含量测定（光度分析法）【原理】双缩脲法是蛋白质光度分析法的一种，是利用蛋白质的双缩脲反应而测定蛋白质含量的方法。因蛋白质含有两个以上的肽键，所以有双缩脲反应。在碱性溶液中蛋白质与Cu2+形成紫红色络合物，其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的分子量及氨基酸成分无关。在一定的实验条件下，未知样品溶液与标准蛋白质溶液同时反应，并于540~560nm测定，即可以通过标准蛋白质的标准曲线求出未知样品的蛋白质浓度。【试剂和器材】一试剂1．标准酪蛋白溶液（5mg/ml）：用0.05mol/LNaOH溶液配制：5g酪蛋白加0.05mol/LNaOH溶液至1000ml。2．双缩脲试剂：溶解1.5g硫酸铜（CuSO4·5H2O）和6.0g酒石酸钾钠（NaKC4H4O6·4H2O）于500ml蒸馏水中。在搅拌下加入10%NaOH溶液300ml，用蒸馏水稀释到1升，贮存在内壁涂有石蜡的瓶中，可长期保存。3．未知蛋白质溶液：γ–球蛋白溶液。二器材分光光度计。【操作】1．标准曲线的绘制：取6支试管按下表操作。试剂123456标准酪蛋白溶液（ml）00.40.81.21.62.0蒸馏水（ml）21.61.20.80.40双缩脲试剂（ml）444444室温下（15~25℃）放置30分钟，用分光光度计于540nm测定。以光密度为纵坐标，酪蛋白含量为横坐标用坐标纸绘制标准曲线。2．γ–球蛋白溶液浓度的测定：取3支试管按下表操作。试剂空白管测定1测定2γ–球蛋白溶液（ml）－11蒸馏水（ml）211双缩脲试剂（ml）444摇匀，放置30分钟，540nm测定读取光密度。【实验结果】求出待测蛋白质溶液的光密度后，从标准曲线上查出其蛋白质浓度，按稀释倍数求出每毫升蛋白质溶液的蛋白质含量。实验三凝胶柱层析法（γ–球蛋白纯化）【原理】凝胶层析（gelchromatography），又称为凝胶过滤（gelfiltration）、分子筛过滤（molecularsievefiltration）、凝胶渗透层析（gelosmoticchromatography）等。它是20世纪60年代发展起来的一种层析技术。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的方法。凝胶是由胶体粒子构成的立体网状结构。网眼里吸满水后凝胶膨胀呈柔软而富于弹性的半固体状态。人工合成的凝胶网眼较均匀地分布在凝胶颗粒上有如筛眼，小于筛眼的物质分子均可通过，大于筛眼的物质分子则不能，故称为“分子筛”。凝胶之所以能将不同分子的物质分开是因为当被分离物质的各成分通过凝胶时，小于筛眼的分子将完全渗入凝胶网眼，并随着流动相的移动沿凝胶网眼孔道移动，从一个颗粒的网眼流出，又进入另一颗粒的网眼，如此连续下去，直到流过整个凝胶柱为止，因而流程长、阻力大、流速慢；大于筛眼的分子则完全被筛眼排阻而不能进入凝胶网眼，只能随流动相沿凝胶颗粒的间隙流动，其流程短、阻力小、流速快，比小分子先流出层析柱；小分子最后流出。分子大小介于完全排阻不能进入或完全渗入凝胶筛眼之间的物质分子，则居中流出。这样被分离物质即被按分子的大小分开。用于凝胶层析的凝胶均为人工合成的产品，主要有交联葡聚糖（商品名为Sephadex）、琼脂糖（商品名为Sepharose）、聚丙烯酰胺凝胶（商品名为Bio–gel）及具有一定网眼的细玻璃珠等和这些凝胶的衍生物。本实验主要介绍葡聚糖凝胶，这是由葡萄糖的多聚物与1–氯–2、3–环氧丙烷（CH2—CH—CH2C1）交连而成。环氧丙烷引入丙三醇基将链状的多聚葡萄糖单位交联起来，凝＼／O胶网眼的大小由多聚葡萄糖的分子和环氧丙烷的比例（交联度）来控制。葡聚糖具有较强的亲水性，在水和电解质溶液中膨胀成为柔软而富于弹性的凝胶，其吸水能力与葡聚糖凝胶的交联度有密切关系。交联度大的，孔径小，吸水少，膨胀的程度小；交联度小的，孔径大，吸水多，膨胀的程度大。因此，葡聚糖凝胶孔径的大小可以其吸水量的大小来表示，常以G–10至G–200号码标记。G后面的数字是其吸水量（毫升水/克干胶）乘以10所得的值。如G–25即表示吸水量为2.5ml/g干胶。市售有G–10、G–25、G–50、G–75、G–100、G–150、G–200等型号。G–75以上的胶因吸水量大，膨胀后形态柔软易变，统称为软胶。G–75以下的称为硬胶。葡聚糖凝胶可分离的分子大小从几百到数十万。可根据被分离物质的分子大小及目的选择使用。一般说SephadexG–l0～15通常用于分离肽及“脱盐”。SephadexG–75～200用以分离各类蛋白质。凝胶层析是一种物理分离法。葡聚糖凝胶基本上不带电荷呈多惰性，不与被分离物质发生反应，所以分离的效果较好。然而由于它是葡萄糖的聚合物，因而仍有少量活性羟基，能吸附少量蛋白质等被分离的物质。为了克服这个缺点，一般使用含有离子强度达0.08的NaCl等中性盐缓冲液作洗脱液。本实验采用凝胶过滤法纯化γ–球蛋白，除去其中的硫酸铵，以达到纯化目的。【试剂和器材】一试剂1．实验二提取出的γ–球蛋白2．磷酸盐缓冲液（pH6.7，0.0175mol）：取0.2mol/LNa2HPO4溶液43.5ml，0.2mol/LNaH2PO4溶液56.6ml混合，用蒸馏水稀释至1000ml。3．SephadexG–25。4．奈氏试剂5．20%磺酰水扬酸6．洗脱液：磷酸盐缓冲液（pH7.0，0.01mol）取0.2mol/LNa2HPO4溶液30.5ml，0.2mol/LNaH2PO4溶液19.4ml混合，加NaCl8.5克，用蒸馏水稀释至1000ml。二器材1．lcm×20cm层析柱2．洗脱瓶。3．部分收集器4．恒流泵5．监测仪【操作】1．凝胶处理：溶胀（水化）：商品葡聚糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶均为干燥颗粒，使用前必须水化溶胀。商品琼脂糖凝胶呈悬浮胶体可直接用，玻璃球不用溶胀。凝胶溶胀有两种方法：一种是将所需葡聚糖凝胶浸入蒸馏水中于室温下溶胀；另一种是置于沸水浴中溶胀。各种葡聚糖在上述溶胀方法中所需的时间见实验原理部分。必须浸泡足够的时间以使凝胶充分溶胀。两种方法中，沸水浴溶胀不但节省时间，还可以杀灭凝胶中污染的细菌并排出网眼。凝胶溶胀后，需用蒸馏水洗涤几次，每次应将沉降缓慢的细小颗粒随水倾倒出去，以免在装柱后产生阻塞现象，降低流速。洗后将凝胶浸泡在洗脱液中待用。一支层析柱中应该装入的干胶量可以用下法推算：称取1g所需型号的葡聚糖干胶，放在5ml量筒中，用室温溶胀的方法充分溶胀，观察溶胀后凝胶的体积。然后在层析柱中加水到所需柱床高度，将水倒出，量取柱床体积。根据1g干胶溶胀后的体积和所需柱床体积，即可推算出干胶的需要量。2．装柱将层析剂装入柱中进行层析的方法称柱层析法。作层析用的柱子称层析柱。层析柱有玻璃和透明塑料的两种。柱子的一端为进口，另一端为出口，出口端底部有烧结玻璃砂板或尼龙布，能阻止层析剂流出，溶剂则可流过。如果没有市售的层析柱，可以选用粗细均匀，长短合适的玻璃管，在两端塞上合适的胶塞，胶塞中插人细玻璃管，在一端放一层尼龙布为出口，即可作为层析柱使用。层析柱的长短粗细根据实验的目的而定，一般说来，凝胶层析时柱越长，分离效果越好。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