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中国农业科学2009,42(3):1009-1015ScientiaAgriculturaSinicadoi:10.3864/j.issn.0578-1752.2009.03.032收稿日期：2008-05-23；接受日期：2008-06-23基金项目：农业部“948”项目（2006-G62）、国家科技基础条件平台项目（2005DKA21201-12）作者简介：史应武（1973－），男，甘肃武山人，博士研究生，研究方向为微生物学。Tel：0991-4533304；E-mail:syw1973@126.comε-聚赖氨酸的生物合成与降解及其应用研究进展史应武1,2，娄恺2，李春1（1石河子大学农学院/新疆兵团化工绿色过程重点实验室，新疆石河子832003；2新疆农业科学院微生物应用研究所，乌鲁木齐830091）摘要：ε-聚赖氨酸(ε-PL)是由赖氨酸的α-氨基与ε-羧基通过肽键结合成的同型聚合物，在高温与酸碱环境中很稳定，作为天然食品防腐剂已经进入工业化发酵生产阶段。ε-PL产生菌通常在细胞膜上具有ε-PL降解酶，以达到保护自己的目的，但ε-PL的微生物合成机理尚不清楚。本文从ε-PL的理化性质、抑菌活性、菌株分离筛选、生物合成与分子遗传学、发酵工艺优化、分离纯化及应用等方面综述了ε-PL的最新研究进展与动态。关键词：ε-聚赖氨酸；生物合成；链霉菌；天然防腐剂AdvanceinResearchonε-PolylysineBiosynthesisandItsDegradationandApplicationSHIYing-wu1,2,LOUKai2,LIChun1(1AgriculturalCollegeofShiheziUniversity/GreenChemicalProcessesKeyLaboratoryinXinjiangBingtuan,Shihezi832003,Xinjiang;2InstituteofMicrobiology,XinjiangAcademyofAgriculturalSciences,Urumqi830091)Abstract:ε-polylysine(ε-PL)isahome-poly-aminoacidcharacterizedbythepeptidebondbetweenthecarboxylandε-aminogroupsofL-lysine,whichisstableathightemperatureandunderbothacidicandalkalineconditions.Duetothisantimicrobialactivity,ε-PLisnowindustriallyproducedasanaturalantisepticagontbyafermentationprocess.ε-PLproducerscommonlypossessmembrane-boundε-PL-degradingaminopeptidase,whichmightplayaroleinself-protection.Itisunknowaboutthebiosyntheticmechanismofε-PL.Thisreviewfocusesonthephysicochemicalpropertiesofε-polylysine,antimicrobialactivitiesofε-polylysine,isolationandscreeningofproducingstrainsofε-polylysine,biosynthesisandmoleculargeneticsofε-polylysine,fermentationprocessoptimizationofε-polylysine,purificationandapplicationofε-polylysine.Keywords:ε-polylysine;biosynthesis;streptomycete;naturalantiseptic0引言防腐剂是一类具有抑制或杀死微生物的化合物，分为化学合成防腐剂与天然防腐剂。随着国民经济的发展和人民生活水平的提高，人们对食品添加剂质量提出更高的要求，化学合成防腐剂受到冷遇，研究开发新型的抗菌性强、安全性能高、使用方便的健康绿色天然防腐剂就成了必然的趋势[1-3]。ε-聚赖氨酸（ε-PL）是目前天然防腐剂中具有优良防腐性能和巨大商业潜力的微生物源天然食品防腐剂，是经分离提取精制而获得的微生物发酵产品。迄今为止ε-PL的微生物发酵在日本已实现工业化，年产千吨ε-PL的现代化工业装置已建成投产。但该技术在国内仍处于实验室阶段，所以研究开发ε-PL具有重要的意义和广阔的前景。本文在介绍了ε-PL研究进展的基础上，提出了其存在的主要问题和研究方向。1ε-聚赖氨酸的理化性质ε-PL是由25～35个L-lysine组成的同型聚合物，通过α-氨基与ε-羧基形成的酰胺键连接而成[4]，结构式如图所示，相对分子量在3500～4500[5]，在水中的溶解度很高，其pI值在9.0左右。ε-PL是淡黄色粉末，吸湿性强，略有苦味；极易溶于水、盐酸，不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂，有好的热稳定性，在100℃加1010中国农业科学42卷热处理30min及120℃加热处理20min，均保持抑菌能力，因此可以方便使用。比旋光度[α]25D为+57.10（c=1，H2O），[α]25D为+39.90（c=1，5mo1·L-1HCl），熔点为250℃。图ε-PL的结构式Fig.Thestructureofε-polylysine2ε-聚赖氨酸抑菌活性与机理ε-PL是一种在水中带正电荷、热稳定、抑菌性能好、安全的多肽，在人体内降解为L-赖氨酸，被誉为“营养型防腐剂”[5]。1984，Shima等采用电镜超薄切片方法研究了ε-PL对E.coliK-12细胞的抑制作用。结果表明，ε-PL不但可以与细菌细胞膜结合而且可以与芽孢结合，影响细菌外膜的正常生理功能。研究还发现，ε-PL的抑菌效果与ε-PL的分子大小有密切关系，ε-PL链长至少要9个氨基酸残基，α-氨基的修饰可以降低ε-PL的活性，表明ε-PL的α-氨基在抑菌中起关键的作用[5]。由于ε-PL为阳离子多聚物，其等电点为9.0，因此ε-PL在中性和微酸性环境条件中具有广谱抑菌性能，而在碱性环境下抑菌活性很低。Delihas[6]等研究发现，ε-PL浓度为1～8mg·L-1时，除了分枝杆菌、结核菌外，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌都具有抑制作用。刘慧等[7]的研究表明，ε-PL对其它天然防腐剂（如Nisin，Natamycin）不能抑制的革兰氏阴性菌如大肠杆菌、沙门氏菌抑菌效果非常好。但对酵母菌、霉菌的抑菌浓度要高，为128～256mg·L-1。此外，它对一些耐热性芽孢杆菌和病毒也有抑制作用。ε-PL是阳离子表面活性物质，易与靶细胞表面带负电的位点结合。Shima等[5]认为，ε-PL通过与细胞膜作用影响微生物的呼吸，与胞内的核糖体结合影响生物大分子的合成。Varra等[8]也认为聚赖氨酸能与细菌的外膜结合，破坏外层膜，并释放大量脂多糖。Delihas[6]等提出ε-PL的抑菌性与细菌的细胞壁结构无必然联系，细菌对ε-PL的敏感性不同可能与细菌类型或细胞表面感应成分的多少或细胞分泌出能降解ε-PL的蛋白酶类的多寡有关。此外，ε-PL空间结构及其α-氨基对抑菌活性也有重要作用。只有全面系统弄清ε-PL抑菌机理，才能更好地应用ε-PL。3ε-聚赖氨酸产生菌的分离筛选20世纪70年代末，Shima等首次从白色链霉菌（Steptomycesalbulus）的发酵液中发现ε-PL[9]。藤井正弘等[10]发现诺尔斯氏链霉菌（Steptomycesnoursei）也可产生PL。Szókán等[11]发现一种丝状的麦角真菌（Clavicepspurpurea）能够积累一种类似PL、含有大量赖氨酸的化合物——麦角胺（clavicepamines），其化学结构与S.albulus的产物不同。从20世纪90年代末至今，筛选ε-PL高产菌株一直是研究的热点。2002年，日本学者Nishikawa等[12]找到了一种有效的筛选方法，通过在培养基中加入一种酸性染料POLYR-478，可以在ε-PL产生菌的菌落周围看到明显的颜色浓缩圈，因而可以进行大规模筛选，克服了盲目性。Nishikawa采用这种方法，对日本各地土壤样品进行了大规模的筛选，获得了许多可以产生ε-PL的菌株，发现大多数ε-PL产生菌集中在链霉菌科（Streptomycetaceae）的几个不同的属和麦角真菌（ergotfungi）这两类微生物上，且不同菌株的产物其赖氨酸单体数也有所不同（n=10～36，10～24，8～9）。并且发现这些菌株大部分属于链霉菌。但由于POLYR-478现已停产，菌株筛选又变得较困难。中国学者王晓丹等[13]、张超等[14]、朱宏阳等[15]采用碱性染料亚甲基蓝，先后分离到了产ε-PL的菌株，但由于亚甲蓝对微生物毒性较高，而且出菌率较低，分离到的菌株均为放线菌，菌种单一，ε-PL产量较低。因此探索筛选培养基指示剂，研究建立高通量、高分辨、高灵敏ε-PL产生菌筛选模型是目前ε-PL研究的难点之一。作者于2005年开始，用RBBR酸性染料作为指示剂对新疆大部分地区土样进行了分离，目前尚无理想结果。4ε-聚赖氨酸微生物合成与分子遗传学ε-PL生物合成的机理至今尚在研究之中。岛昭二等[16]通过将14C-L-Lys渗入培养基中，验证了L-Lys是ε-PL生物合成的前体物，这表明ε-PL是由ε-PL聚合酶催化合成的并被转运到胞外。Kawai等[17]通过无细胞系统研究了ε-PL的体外生物合成。结果表明，ε-PL的生物合成依赖于ATP，而不受核糖核酸酶、卡那霉素和氯霉素的影响，并且检测到细胞膜具有ε-PL生物合成活性，由此表明ε-PL合成不是核糖体缩氨酸3期史应武等：ε-聚赖氨酸的生物合成与降解及其应用研究进展1011合成，而是由膜上酶催化合成。Lipmann[18]和Zocher等[19]先后报道了具有抑菌活性的短肽通常由缩肽酶在非核糖体中完成。在以Streptomycesalbulus346为出发菌株，筛选S-（2-aminoethyl）-l-cysteine突变体时，发现ε-PL高产菌株中天冬氨酸转移酶增高。天冬氨酸转移酶是ε-PL发酵中的一个关键酶，可以推断一个非核糖体的ε-PL合成酶系统以L-lysine底物参与了ε-PL的生物合成。但是涉及ε-PL合成酶的酶学性质仍然是未知的。目前ε-PL合成酶基因的克隆及表达既是研究的难点，也是问题的焦点。为了阐明ε-PL生物合成机理，研究者对ε-PL合成相关基因进行了研究，但还没有直接的鉴定和功能分析。Takagi等[20]报道，在ε-PL产生菌白色链霉菌IF014147中发现了一种高分子量（37kb）隐蔽性质粒pNO33，由于目前该质粒只在产生ε-PL的白色链霉菌中发现，因此它可能是编码ε-PL合成或抗性基因。在以pNO33DNA为探针采用Southern杂交对不产ε-PL的菌株S.albulus和S.noursei进行了分析，结果均未发现pNO33质粒。目前对pNO33的全序列及功能尚无报道，以pNO33为载体，进行了IFO14147菌株β-内酰胺酶基因的克隆与分析，结果表明β-内酰胺酶的产生是由氨苄青霉素诱导的[21]。研究还发现，发酵液在pH4.0时，白色链霉菌可以很快合成和分泌ε-PL，而当pH5.0～8.0时，ε-PL则立即被降解，这说明存在ε-PL降解酶。Kito等[22]对来自S.albulus的ε-PL降解酶进行了克隆与功能分析。结果发现，S.albulus的ε-PL降解酶活性与S.albulus的ε-PL高产特性及ε-PL抗性紧密相关，这很可能是S.albulus产ε-PL所必需的。研究表明，ε-PL降解酶基因序列与S.coelicolor的金属蛋白酶基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