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酵母双杂交酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。典型的真核生物转录因子,如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域:DNA结合结构域(DNA-bindingdomain)和转录激活结构域(transcription-activatingdomain)。前者可识别DNA上的特异序列,并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游,转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用,启动它所调节的基因的转录。1、基本思想酵母双杂交由Fields在1989年提出.他的产生是基于对真核细胞转录因子特别是酵母转录因子GAL4性质的研究.GAL4包括两个彼此分离的但功能必需的结构域.位于N端1-147位氨基酸残基区段的DNA结合域(DNAbindingdomain,DNA-BD)和位于C端768-881位氨基酸残基区段的转录激活域(Activationdomain,AD).DNA-BD能够识别位于GAL4效应基因(GAL4-responsivegene)的上游激活序列(Upstreamactivatingsequence,UAS),并与之结合.而AD则是通过与转录机构(transcriptionmachinery)中的其他成分之间的结合作用,以启动UAS下游的基因进行转录.DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应,但是当二者在空间上充分接近时,则呈现完整的GAL4转录因子活性并可激活UAS下游启动子,使启动子下游基因得到转录.Fields建立了一个双杂交系统,BD与X蛋白融合,AD与Y蛋白融合,如果X、Y之间形成蛋白-蛋白复合物,使GAL4两个结构域重新构成,则会启动特异基因序列的转录.他们利用Snf1与Snf4的相互作用,将Snf1与BD融合,Snf4与AD融合,构建在穿梭质粒上.其中Snf1是一种依赖于丝氨酸、苏氨酸的蛋白激酶,Snf4是他的一个结合蛋白.研究者将二种穿梭质粒转化酵母GGY:171菌株,该菌株含有LacZ报告基因,并已去除相应转录因子基因.该实验的结果表明由Snf1和Snf4相互作用使得AD和BD在空间上接近,激活了报告基因LacZ的转录.一般地,将BD-X的融合蛋白称作诱饵(bait),X往往是已知蛋白,AD-Y称作猎物(prey),能显示诱饵和猎物相互作用的基因称报告基因,通过对报告基因的检测,反过来可判断诱饵和猎物之间是否存在相互作用.2、基本原理双杂交系统的建立得力于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。80年代的工作表明,转录激活因子在结构上是组件式的(modular),即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有DNA结合结构域(DNAbindingdomain,简称为BD)和转录激活结构域(activationdomain,简称为AD),它们是转录激活因子发挥功能所必需的。前者可识别DNA上的特异序列,并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游,转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用,启动它所调节的基因的转录。两个结构域不但可在其连接区适当部位打开,仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白-蛋白的相互作用。单独的BD虽然能和启动子结合,但是不能激活转录。而不同转录激活因子的BD和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。如酵母细胞的Gal4蛋白的BD与大肠杆菌的一个酸性激活结构域B42融合得到的杂合蛋白仍然可结合到Gal4结合位点并激活转录。主要有二类载体:a含DNA-bindingdomain的载体;b含DNA-activatingdomain的载体。一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA-结合结构域(如GAL4-bd,LexA-bd);另一个蛋白的基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad,VP16)。上述二类载体在构建融合基因时,测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。融合基因在报告株中表达,其表达产物只有定位于核内才能驱动报告基因的转录。例如GAL4-bd具有核定位序列(nuclear-localizationsequence),而GAL4-ad没有。因此,在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。目前研究中常用binding-domain基因有:GAL4(1-147);LexA(Ecoli转录抑制因子)的DNA-bd编码序列。常用的activating-domain基因有:GAL4(768-881)和疱疹病毒VP16的编码序列等。双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。报道株指经改造的、含报道基因(reportergene)的重组质粒的宿主细胞。最常用的是酵母细胞,酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点:〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中,蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ),从而可分析蛋白间的结合作用。酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用,具有高度敏感性。主要是由于:①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行,而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤,降低了信号强度。③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强,后者又与启动子DNA结合,此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型,X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感。3、发展随着对多种重要生物的大规模基因组测序工作的完成,基因工程领域又迎来了一个新的时代---功能基因组时代。它的任务就是对基因组中包含的全部基因的功能加以认识。生物体系的运作与蛋白质之间的互相作用密不可分,例如:DNA合成、基因转录激活、蛋白质翻译、修饰和定位以及信息传导等重要的生物过程均涉及到蛋白质复合体的作用。能够发现和验证在生物体中相互作用的蛋白质与核酸、蛋白质与蛋白质是认识它们生物学功能的第一步。酵母双杂交技术作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台,在近几年来得到了广泛运用。酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的,研究活细胞内蛋白质相互作用,对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到,它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明,酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作,也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此,它在许多的研究领域中有着广泛的应用。本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍。酵母双杂交系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。细胞起始基因转录需要有反式转录激活因子的参与。反式转录激活因子,例如酵母转录因子GAL4在结构上是组件式的(modular),往往由两个或两个以上结构上可以分开,功能上相互独立的结构域(domain)构成,其中有DNA结合功能域(DNAbindingdomain,DNA-BD)和转录激活结构域(activationdomain,DNA-AD)。这两个结合域将它们分开时仍分别具有功能,但不能激活转录,只有当被分开的两者通过适当的途径在空间上较为接近时,才能重新呈现完整的GAL4转录因子活性,并可激活上游激活序列(upstreamactivatingsequence,UAS)的下游启动子,使启动子下游基因得到转录。根据这个特性,将编码DNA-BD的基因与已知蛋白质Baitprotein的基因构建在同一个表达载体上,在酵母中表达两者的融合蛋白BD-Baitprotein。将编码AD的基因和cDNA文库的基因构建在AD-LIBRARY表达载体上。同时将上述两种载体转化改造后的酵母,这种改造后的酵母细胞的基因组中既不能产生GAL4,又不能合成LEU、TRP、HIS、ADE,因此,酵母在缺乏这些营养的培养基上无法正常生长。当上述两种载体所表达的融合蛋白能够相互作用时,功能重建的反式作用因子能够激活酵母基因组中的报告基因HIS、ADE、LACZ、MEL1,从而通过功能互补和显色反应筛选到阳性菌落。将阳性反应的酵母菌株中的AD-LIBRARY载体提取分离出来,从而对载体中插入的文库基因进行测序和分析工作。在酵母双杂交的基础上,又发展出了酵母单杂交、酵母三杂交和酵母的反向杂交技术。它们被分别用于核酸和文库蛋白之间的研究、三种不同蛋白之间的互作研究和两种蛋白相互作用的结构和位点。4、文库筛选将待测基因与Gal4或LexA或其他合适蛋白的DNA结合域融合构建诱饵质粒;将诱饵质粒转化缺乏报告基因启动子的酵母细胞株中,选择被转化的酵母;再将文库质粒转化到酵母中。通过报告基因的功能筛选相互作用的蛋白,从酵母中分离质粒然后转化E.coli,从大肠杆菌中提取质粒并测序,在数据库中比对所测定序列与已知蛋白的同源性。5、结构组成酵母双杂交系统可应用于确定两已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域。利用此系统已分析和测定了多种重要结构域,如p85三磷酸肌醇激酶和p110亚单位作用的结构域v,p21cip1蛋白与增殖细胞核抗原(proliferating-cellnuclearantigen,PCNA)的结合序列vi等。此外酵母双杂交系统还应用于阐明蛋白质相互作用的结构域,绘制蛋白质联系图谱,在药物设计等许多方面。6、应用酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的,研究活细胞内蛋白质相互作用,对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到,它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。大量的研究文献表明,酵母双杂交技术既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的互作,也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的互作。因此,它在许多的研究领域中有着广泛的应用。发现新的蛋白质和蛋白质的新功能酵母双杂交技术已经成为发现新基因的主要途径。当我们将已知基因作为诱饵,在选定的cDNA文库中筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白,从筛选到的阳性酵母菌株中可以分离得到AD-LIBRARY载体,并从载体中进一步克隆得到随机插入的cDNA片段,并对该片段的编码序列在GENBANK中进行比较,研究与已知基因在生物学功能上的联系。另外,也可作为研究已知基因的新功能或多个筛选到的已知基因之间功能相关的主要方法。例如:Engelender等人以神经末端蛋白alpha-synuclein蛋白为诱饵蛋白,利用酵母双杂交CLONTECHMATCHMARKERSYSTEM3为操作平台,从成人脑cDNA文库中发现了与alpha-synuclein相互作用的新蛋白Synphilin-1,并证明了Synphilin-1与alpha-synuclein之间的相互作用与帕金森病的发病有密切相关。为了研究两个蛋白之间的相互作用的结合位点,找到影响或抑制两个蛋白相互作用的因素,Michael等人又利用酵母双杂交技术和基因修饰证明了alpha-synuclein的1-65个氨基酸残基和Synphilin-1的349-555个氨基酸残基之间是相互作用的位点。研究它们之间的相互作用位点有利于基因治疗药物的开发。在细胞体内研究抗原和抗体的相互作用利用酶联免疫(ELISA)、免疫共沉淀(CO-IP)技术都是利用抗原和抗体间的免疫反应,可以研究抗原和抗体之间的相互作用,但是,它们都是基于体外非细胞的环境中研究蛋白质与蛋白质的相互作用。而在细胞体内的抗原和抗体的聚积反应则可以通过酵母双杂交进行检测。例如:来源于矮牵牛的黄烷酮醇还原酶DFR与其抗体scFv的反应中,抗体的单链的三个可变区A4、G4、H3与抗原之间作用有强弱的差异。Geert等利用酵母双杂交技术,将DFR作为诱饵蛋白,编
本文标题:酵母双杂交
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