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DBS22吉林省地方标准DBS22/003—2014食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检测2014-07-30发布2014-08-30实施吉林省卫生和计划生育委员会发布DBS22/003—20141吉林省食品安全地方标准食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检测1范围本标准规定了食品中单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）的检验方法。本标准适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的定量检验。2定义和术语2.1单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）单核细胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌属中唯一引起人类致病菌的病原菌，亦可人畜共患。感染后主要表现为败血症、脑膜炎和单核细胞增多。它广泛存在于自然界中，食品中存在的单增李氏菌对人类的安全具有危险，该菌在4℃的环境中仍可生长繁殖，是冷藏食品威胁人类健康的主要病原菌之一。3设备和材料除微生物实验室常规无菌及培养设备外，其他设备和材料如下：3.1冰箱：2℃～5℃和-15℃。3.2恒温培养箱：30℃±1℃、36℃±1℃。3.3均质器。3.4显微镜：10×～100×。3.5电子天平：感量0.1g。3.6全自动微生物生化鉴定系统。3.7锥形瓶：100mL、500mL。3.8无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）。3.9无菌平皿：直径90mm。3.10无菌试管：16mm×160mm.。3.11离心管：10mL～50mL。3.12无菌注射器：1mL。3.13L棒4培养基和试剂4.1含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆肉汤（TSB-YE）：见附录A中A.1。4.2含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）：见附录A中A.2。4.3李氏增菌肉汤LB（LB1，LB2）：见附录A中A.3。DBS22/003—201424.41%盐酸吖啶黄（acriflavineHCl）溶液：见附录A中A.3.2.1。4.51%萘啶酮酸钠盐（naladixicacid）溶液：见附录A中A.3.2.1。4.6PALCAM琼脂：见附录A中A.4。4.7革兰氏染液：见附录A中A.5。4.8SIM动力培养基：见附录A中A.6。4.9缓冲葡萄糖蛋白胨水[甲基红（MR）和V-P试验用]：见附录A中A.7。4.105%-8%羊血琼脂：见附录A中A.8。4.11糖发酵管：见附录A中A.9。4.12过氧化氢酶试验：见附录A中A.10。4.13李斯特氏菌显色培养基。4.14APIlisteria10300生化鉴定试剂盒。（由法国生物梅里埃公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标本的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果，则可使用这些等效的产品。）4.15金黄色葡萄球菌（ATCC25923）。4.16马红球菌（Rhodococcusequi）。第一法单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法5平板计数法实验原理应用涂布法，单核细胞增生李斯特氏菌在选择鉴别培养基（如李斯特氏菌显色培养基或PALCAM琼脂）上显示可鉴别的特征性菌落，对确证为李斯特菌的菌落进行计数，并根据样液稀释倍数和接种样量换算每克样品的李斯特氏菌数。此方法适用与未经加工处理的生鲜食品或污染情况可能较重的水和食品。6平板计数法检验程序单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法检验程序见图1。DBS22/003—2014310倍系列稀释检样25g(mL)样品+225mLPBS或生理盐水稀释液，均质选取2个~3个适宜的连续稀释度的样品匀液，涂布李斯特氏菌显色培养基或PALCAM琼脂平板典型菌落计数及确证试验报告36℃±1℃24h～48h10倍系列稀释检样25g(mL)样品+225mLPBS或生理盐水稀释液，均质选取2个~3个适宜的连续稀释度的样品匀液，涂布李斯特氏菌显色培养基或PALCAM琼脂平板典型菌落计数及确证试验报告36℃±1℃24h～48h图1单核细胞增生李斯特氏菌平板计数法检验程序7操作步骤7.1样品保存冷冻样品应在45℃以下不超过15min或在2℃～5℃不超过18h解冻，若不能及时检验，应放于-15℃左右保存；非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验，若不能及时检验，应置于2℃～5℃冰箱保存，24h内检验。7.2样品处理7.2.1固态样品：无菌称取样品25g，放入盛有225mLPBS或生理盐水的无菌均质杯内，用均质器以8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mLPBS或生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。7.2.2液态样品：无菌吸取样品25mL至盛有225mLPBS或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀，制成1:10的样品匀液。DBS22/003—201447.3样品稀释吸取上述1:10的样品匀液1mL加到装有9mLPBS或生理盐水的稀释管中，充分混匀制成1:100的样品匀液。据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。7.4样品接种与培养根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个连续的适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），以0.3mL、0.3mL、0.4mL接种量分别加入三块李斯特显色平板或PALCAM琼脂平板，然后用无菌“L”棒涂布整个平板。使用前，如李斯特显色平板或PALCAM琼脂平板表面如有水珠，可放在25℃～50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。在通常情况下，涂布后，将平板静置10min。如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36℃±1℃培养1h，等样液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，36℃±1℃培养24h±2h。如果菌落不典型,可继续培养至48h±2h再观察。7.5典型菌落观察在科玛嘉李斯特氏菌显色培养基上，典型菌落为小的圆形蓝色菌落，周围有白色晕圈（其它品牌李斯特氏菌显色培养基上的菌落特征按照产品说明书判定）。在PALCAM琼脂培养基上，典型菌落为小的圆形灰绿色菌落，周围有棕黑色水解圈，有些菌落有黑色凹陷。7.6确证实验7.6.1初筛自李斯特显色或PALCAM琼脂平板上分别挑取5个以上典型或可疑菌落，分别接种在木糖、鼠李糖发酵管于36℃±1℃培养24h；同时在含0.6%酵母浸膏的胰酪胨大豆琼脂（TSA-YE）平板上划线纯化，于30℃±1℃培养24h～48h。选择木糖阴性、鼠李糖阳性的纯培养物继续进行鉴定。7.6.2鉴定7.6.2.1染色镜检：李斯特氏菌为革兰氏阳性短杆菌。7.6.2.2动力试验：用生理盐水制成菌悬液，在油镜或相差显微镜下观察，该菌出现轻微旋转或翻滚样的运动。SIM半固体培养李斯特氏菌有动力，呈伞状生长或月牙状生长。7.6.2.3生化鉴定：挑取纯培养的单个可疑菌落，进行过氧化氢酶试验，将过氧化氢酶阳性反应的菌落继续进行糖发酵试验和MR-VP试验。单核细胞增生李斯特氏菌的主要生化特征见表1。7.6.2.4溶血试验：将羊血琼脂平板底面划分为20个～25个小格，挑取纯培养的单个可疑菌落刺种到血平板上，每格刺种一个菌落，并刺种阳性对照菌（单增李斯特氏菌和伊氏李斯特氏菌）和阴性对照菌（英诺克李斯特氏菌），穿刺时尽量接近底部，但不要触到底面，同时避免琼脂破裂，36℃±1℃培养24h～48h，于明亮处观察，单增李斯特氏菌和斯氏李斯特氏菌在刺种点周围产生狭小的透明溶血环，英诺克李斯特氏菌无溶血环，伊氏李斯特氏菌产生大的透明溶血环。7.6.2.5协同溶血试验（cAMP）：在羊血琼脂平板上平行划线接种金黄色葡萄球菌和马红球菌，挑取纯培养的单个可疑菌落垂直划线接种于平行线之间，垂直线两端不要触及平行线，于30℃±1℃培养24h～48h。单核细胞增生李斯特氏菌在靠近金黄色葡萄球菌的接种端溶血增强，斯氏李斯特氏菌的溶血也增强，而伊氏李斯特氏菌在靠近马红球菌的接种端溶血增强。7.6.2.6可选择APIlisteria10300生化鉴定试剂盒或全自动微生物鉴定系统等生化鉴定系统。DBS22/003—20145表1单核细胞增生李斯特氏菌生化特征与其他李斯特氏菌的区别菌种溶血反应葡萄糖麦芽糖MR-VP甘露醇鼠李糖木糖七叶苷单核细胞增生李斯特氏菌（L.monocytogenes）＋＋＋＋/＋－＋－＋格氏李斯特氏菌（L.grayi）－＋＋＋/＋＋－－＋斯氏李斯特氏菌（L.seeligeri）＋＋＋＋/＋－－＋＋威氏李斯特氏菌（L.welshimeri）－＋＋＋/＋－V＋＋伊氏李斯特氏菌（L.ivanovii）＋＋＋＋/＋－－＋＋英诺克李斯特氏菌（L.innocua）－＋＋＋/＋－V－＋注：＋阳性；－阴性；V反应不定。8平板计数法结果计算选择有典型单增李斯特氏菌菌落的平板，且同一稀释度3个平板所有菌落数合计在20CFU～200CFU之间的平板，计数典型菌落数。如果：a)只有一个稀释度的平板菌落数在20CFU～200CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；b)所有稀释度的平板菌落数均小于20CFU且有典型菌落，应计数最低稀释度平板上的典型菌落；c)某一稀释度的平板菌落数大于200CFU且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；d)若所有稀释度的平板菌落数大于200CFU且有典型菌落，应计数最高稀释度平板上的典型菌落；e)若所有稀释度的平板菌落数均不在20CFU～200CFU之间且有典型菌落，其中一部分小于20CFU或大于200CFU时，应计数最接近20CFU或200CFU的稀释度平板上的典型菌落。以上按公式（1）计算。公式（1）：T=dCBA…………………………………（1）式中：T——样品中单增李斯特氏菌的菌落数；A——某一稀释度单增李斯特氏菌的典型菌落总数；B——鉴定结果为单增李斯特氏菌的菌落数；C——用于单增李斯特氏菌鉴定的菌落数；d——稀释因子。f）若2个连续稀释度的平板菌落数均在20CFU～200CFU之间，按公式（2）计算公式（2）：…………………………………………（2）d.11222111CBACBATDBS22/003—20146式中：T——样品中单增李斯特氏菌的菌落数；A1——第一稀释度（低稀释倍数）单增李斯特氏菌典型菌落的总数；A2——第二稀释度（高稀释倍数）单增李斯特氏菌典型菌落的总数；B1——第一稀释度（低稀释倍数）鉴定结果为单增李斯特氏菌的菌落数；B2——第二稀释度（高稀释倍数）鉴定结果为单增李斯特氏菌的菌落数；C1——第一稀释度（低稀释倍数）用于单增李斯特氏菌鉴定的菌落数；C2——第二稀释度（高稀释倍数）用于单增李斯特氏菌鉴定的菌落数；1.1——计算系数（如果第二稀释度单增李斯特氏菌鉴定结果为0，计算系数采用1）；d——稀释因子（第一稀释度）。9平板计数法结果报告根据李斯特氏菌显色培养基或PALCAM琼脂平板上单核细胞增生李斯特氏菌的典型菌落数和确证实验结果，按8中公式计算，报告样品中单核细胞增生李斯特氏菌的菌落数，以CFU/g(mL)表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。第二法单核细胞增生李斯特氏MPN计数法10单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法的实验原理应用MPN9管法，选择三个适宜的连续稀释度样液接种于选择性增菌液李氏增菌肉汤LB（LB1,LB2），进行两次选择性增菌，经确证实验证明含有单核细胞增生李斯特氏菌菌落的对应管计为阳性管，查MPN表，计数并报告每克或每毫升样品的单核细胞增生李斯特氏菌MPN值。此方法适用于污染程度低的样品。11MPN计数法检验程序单核细胞增生李斯特氏菌MPN计数法检验程序见图2DBS22/003—20147检样25g(ml)样品+225mlLB1增菌液，均质10倍系列稀释选择3个连续的适宜稀释度的样品匀液，每个稀释度各取1ml分别接种于3管LB1增菌液30℃±1℃，18h～24h每管各取0.1ml分别接种于1管LB2增菌液李斯特氏菌显色培养基PALCAM培养基36℃±1℃，24h±2h30℃±1℃，18h～24h确证
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