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批准号：30271525/C03020707项目名称：黄酮类药物体内代谢研究与结构优化一、简表二、立论依据（包括项目的研究意义、国内外研究现状分析，并附主要参考文献及出处）对基础研究，着重结合国际科学发展趋势，论述项目的科学意义；对应用基础研究，着重结合学科前沿、围绕国民经济和社会发展中的重要科技问题，论述其应用情景。黄酮类化合物是分布于植物界的一大类化合物。为了更好地了解黄酮类药物体内作用机理、作用过程，必须明确其在体内的吸收、分布、代谢和清除过程。而早期获得体内动力学和代谢数据，不仅可指导临床安全、有效用药，也可为结构改造提供依据，以改善药动学性质，提高临床疗效。在天然化合物开发过程中，曾对青蒿素进行烷基化和酰化结构修饰得到蒿甲醚和青蒿琥酯[8]，二者动力学性质明显优于青蒿素，抗疟活性提高了5-6倍。目前对黄酮类药物体内情况的研究尚处于起步阶段。仅有的一些报道也多集中在槲皮素、芦丁、葛根素等少数几个黄酮类药物的研究[9-13]。药动学上的特点可能与黄酮类化合物特定化学结构有关。这类化合物的基本结构为2-苯基色原酮，为平面型分子，分子间引力较大，导致其难溶于水，口服吸收差；而分子结构中又具有多个酚羟基，易于内源性的葡萄糖醛酸、硫酸等发生结合反应，首过代谢强。本课题组曾受香港科技大学委托对具有抗焦虑活性的汉黄芩素在大鼠体内的代谢及动力学行为进行了初步研究，发现该药口服后，在大鼠血浆中主要以结合型代谢产物汉黄芩素-7-O-葡萄糖苷酸为主，其血浆浓度是原形药物的100倍以上[14]；但该药自体内清除时，却主要以原形从尿中排泄，粪便中检测不到原形药物和结合型代谢物，这一现象难于解释，清除机制还需进一步研究。对保肝利胆药水飞蓟素药动学研究发现，不同剂型的水飞蓟素口服生物利用度影响可达3-5倍[15]。目前，虽对少数几种黄酮类药物的吸收、血浆动力学有所认识，但对其体内组织的存在形式以及发挥药效作用的物质基础尚不明确。而体内循环的存在形式将影响它们的极性进而影响其在体内的分布和生物活性，因此，这是进行黄酮类药物体内药效作用机理研究首先需要解决的问题。研究黄酮类药物体内过程，首要问题是解决对生物样品（血浆、尿、组织等）中原形药物及代谢产物的测定。目前应用最为广泛的方法是反相HPLC法，由于选择性较差，这一方法仅能对酶水解后总黄酮（包括黄酮苷元和结合型代谢产物）进行测定，提供的检测限一般为几十ng/ml，不能满足苷元药动学研究的需要，因此需建立灵敏度高、选择性强的方法直接测定苷元和结合型代谢产物。液相色谱−串联质谱技术由于可同时监测待测物的母离子和产物离子大大提高了检测的选择性，降低了血浆中内源性物质的干扰，而使检测灵敏度比HPLC法提高1-2个数量级。本室已首次建立了液相色谱−串联质谱直接测定血浆中汉黄芩素，定量下限为0.25ng/ml，比文献报道的HPLC法[16]（100ng/ml）灵敏度提高了400倍。液相色谱−离子阱质谱技术将离子阱捕获、贮存离子的功能应用于质谱分析，不仅能提供待测物的分子量，还可对待测物进行多级产物离子扫描，提高了结构鉴定的可靠性。这些新方法的建立将使黄酮类药物体内动力学和代谢深入研究成为可能。本项目拟选择4个具有代表性结构、临床或药理实验已证明具有明确疗效但药物代谢和动力学性质不明确的黄酮类药物，对其进行系统深入研究，包括体内过程、体内存在形式、化学结构改造。拟研究的4种黄酮类药物分别为用于改善微血管循环的野黄芩素、具有抗焦虑活性的汉黄芩素、抗缺血作用的葛根黄豆苷元及抗氧化剂山柰酚，结构如下：在化学结构上，除葛根黄豆苷元属异黄酮类化合物，其他三种为黄酮类化合物；分子中都含有多个酚羟基，但取代位置不同（如图），仅山柰酚含有3位酚羟基，这是抗氧化作用的活性基团。本研究拟采用液相色谱−离子阱质谱技术鉴定其体内代谢过程；采用高灵敏的液相色谱−串联质谱法系统研究此类化合物静注和口服给药后体内母体药物及主要代谢产物的动力学性质，研究其在肝脏、小肠、结肠、肾脏、胆汁、脑等组织的存在形式和浓度水平，研究黄酮类药物及结合型代谢物透过血脑屏障的速度和程度（有些黄酮类药物具有中枢神经系统作用），确定黄酮类药物体内生物活性的化学物质基础；探讨该类药物的吸收及代谢特别是首过代谢对药动学性质的影响。本课题也将利用肝微粒体、线粒体等亚细胞成分进行体外代谢研究，确认参与黄酮类药物体内代谢的酶系，及服用这些药物对CYP450和UGTs酶活性的影响以考察黄酮类药物是否诱导或抑制自身代谢。在上述研究的基础上，尝试通过化学合成方法，在结构中导入不同基团如氨基酸酯、氨甲酸酯、半琥珀酸酯、羟烷基醚、二甲氨基乙基醚、酯醚等，以改善黄酮类化合物溶解度提高吸收或阻断首过代谢，从而获得生物利用度显著改善的新结构。本项目的研究结果将首次系统提供黄酮类药物的代谢及动力学数据，阐明其药效的生物化学基础，为开发这类化合物提供基本科学依据。同时也为溶解度低、首过代谢强的多酚类药物动力学性质改善提供有效的方法，为植物中有效成分的开发提供新思路。主要参考文献[1]WuJA,AtteleAS,ZhangLetal.Anti-HIVactivityofmedicinalherbs:usageandpotentialdevelopment.AmJClinMed,2001,29,69[2]SaliouC,RihnB,CillardJ,etal.SelectiveinhibitionofNF-KappaBactivationbytheflavonoidhepatoprtectorsilymarininhepG2.Evidencefordifferentactivatingpathways.FEBSLett,1998,440,8[3]HertogMGL,FeskensEJM,HollmanPCH,etal.Dietaryantioxidantflavonoidsandriskofcoronaryheartdisease:theZutphenelderlystudy.Lancet,1993,342,1007[4]Rice-EvansC.Flavonoidsantioxidants.CurrMedChem,2001,8,797[5]CarlsonBA,DubayMM,SausvilleEA,etal.FlavopiridolinducesG.arrestwithinhibitionofcyclin-dependentkinase(CDK2andCDK4)inhumanbreastcarcinomacells.CancerRes,1996,56,2973[6]PaladiniAC,MarderM,ViolaH,etal.Flavonoidsandthecentralnervoussystem:fromforgottenfactorstopotentanxiolyticcompounds.JPharmPharmacol,1999,51,912[7]UengYF,ShyuCC,LinYL,etal.Effectofbaiceleinandwogoninondrug-metabolizingenzymesinC57BL/6Jmice.LifeSci,2000,67,2189[8]VromanJA,Alvim-GastonM,AveryMA.Currentprogressinthechemistry,medicinalchemistryanddrugdesignofartemisininbasedantimalarials.CurrPharmDes,1999,5,101[9]HeilmannJ,MerfortI.AktuellerkenntnisstandzummetabolismusvonflavonoidenII.Resorptionundmetabolismusvonflavonen,flavanonen,flavanen,proantho-cyanidinenundisoflavonoiden.PharmazieinunsererZeit.1998,27,173[10]MorandC,ManachC,CrespyV,etal.Respectivebioavailabilityofquercetinaglyconeanditsglycosidesinaratmodel.Biofactors,2000,12,169[11]Pharmacokineticsofquercetinfromquercetinaglyconeandrutininhealthyvolunteers.EurJClinPharmacol,2000,56,545[12]AndlauerW,StumpfC,FurstP.Instituteabsorptionofrutininfreeandconjugatedforms.BiochemPharmacol,2001,62,369[13]Rice-EvansC,SpencerJP,SchroeterH,etal.Bioavailabilityofflavonoidsandpotentialbioactiveformsinvivo.DrugMetabolDrugInteract,2000,17,291TsaiTH,ChouCJ,TsaiTR,etal.Determinationofwogonininratplasmabyliquidchromatographyanditspharmacokineticapplication.PlantaMed,1996,62,263三、研究方案1.研究目标、研究内容和拟解决的关键问题研究目标:1)探讨不同结构特点的黄酮类药物药物动力学特征，阐明吸收及代谢过程，特别是首过代谢对生物利用度的影响。研究黄酮类药物在不同组织部位的存在形式和浓度水平，确定其体内生物活性的化学基础。2)确认参与黄酮类药物体内代谢的酶系，及服用这些药物对CYP450和UGTs酶活性的影响以考察黄酮类药物是否诱导或抑制自身代谢。3)探讨在结构中导入不同基团对黄酮类药物吸收和代谢的影响，以获得生物利用度改善的新结构。研究内容：1)建立灵敏、快速的液相色谱−串联质谱法测定生物样品中黄酮类药物及其主要代谢产物。2)采用液相色谱−离子阱质谱法鉴定拟研究的4种黄酮类药物体内代谢产物和排泄途径。采用肝微粒体、线粒体等亚细胞成分进行体外代谢研究，并制备代谢物对照品。考察黄酮类药物对主要的一相代谢酶CYP3A4,2C9,2C19,2D6，2E1及二相代谢酶UGT1A,2B活性的影响。3)研究4种黄酮类药物静注和口服给药后的药物动力学性质，考察小肠吸收及首过代谢对药物动力学的影响。研究黄酮类药物在不同组织的存在形式和浓度水平，确定体内生物活性的化学基础。4)在4种黄酮类药物结构中分别导入特定化学基团，增加水溶性或阻断首过代谢以提高生物利用度。拟解决的关键问题：生物样品中黄酮类药物代谢物的鉴定及微量组分的定量分析方法导入新官能团以改善黄酮类药物动力学及代谢行为2.拟采取的研究方法、技术路线、实验方案及可行性分析1)生物体内黄酮类药物及其主要代谢产物的定量分析方法建立依据待测物的结构特点和理化性质，在已有的工作基础上，优化生物样品预处理方法，选择合适的离子化源，建立液相色谱−串联质谱法定性和定量分析生物样品中4种黄酮类药物及代谢产物，方法的定量下限1ng/ml，比目前使用HPLC法提高10倍以上。2)4种黄酮类药物代谢酶系及酶诱导和抑制作用研究收集大鼠服用前、后尿样和粪便，采用液相色谱−离子阱质谱法进行分析，利用色谱保留时间和多级质谱断裂规律，推测可能的代谢产物。采用肝微粒体、线粒体等亚细胞成分进行体外代谢研究，制备代谢物对照品。通过计算酶动力学常数Km和Vmax，考察黄酮类药物对主要的一相代谢酶CYP3A4,2C9,2C19,2D6及二相代谢酶UGT1A,2B活性的影响。3)4种黄酮类药物吸收、药物动力学、组织分布研究通过对生物样品中母体药物和主要代谢产物的液相色谱−串联质谱法分析，测定大
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